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検査工程(Identigene Laboratory)
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※代表してIdentigene研究所の工程をご紹介しています。


ローカスのDNA検査サービスは裁判を目的とした親子鑑定から学術研究のための家族関係の再構築まで多岐にわたっています。ローカスで行われるDNA検査は、多くの認証機関で認定された研究所で行われており、正確で厳格な管理を迅速に提供しております。

研究所では、高付加価値の検査品質保証として、バーコード化したサンプル管理による大規模な検査工程の確立と検査情報管理システム(LIMS)を開発し展開しています。ローカス と研究所ではDNA検査の結果が信頼でき正確なものであることを依頼者に提供するために厳格な管理と顧客管理の予防に全力を尽くしています。

以下の説明において申込みから鑑定書の送付までDNA鑑定のプロセスをご覧いただけます。

DNA検査工程

サンプルの採取方法

 

  1. 依頼者はまずローカスに検査(親子鑑定、きょうだい鑑定、祖父母と孫鑑定等)を依頼します
  2. DNA採取を当社のDNAバーコード化した採取専用キットを使用して採取をします。
  3. すべての参加者はかならず対面によるインフォームドコンセントを行い申込書に承諾をした署名が必要になります。すべての検査には私的用と裁判用があります。
     
    • 私的用鑑定は主に家族関係の確認を目的とした検査ですが、採取にはローカスから指定されている人物によりインフォームドコンセントと採取がされている必要があります。この検査は裁判用に準拠していますが、一部省略している部分もあり、公的機関に提出することはできません。ローカスでは第三者証明付きのものとしてこの鑑定書を発行しません。
    • 裁判用鑑定はローカスから特に指定された人物により厳格に各参加者の確認と証明を行って採取されます。鑑定書と採取記録証明書を通じてこの検査が裁判において立証できる証拠性の高い鑑定書として発行します。
       
  4. ローカスはサンプルを確認し、提携研究所にて以下の工程に従い結果を提供します。

検査の基本工程とサンプルの汚染予防

研究所には4つの完全に独立した検査室があります。

  1. DNA抽出のための手順(同一の検査室内の分離したスペースで行われます)
  2. PCRの設定
  3. 増幅
  4. 検出

 

作業の流れは常に単一の方向(一方通行)で行われます。これは検出から抽出までにDNAの増幅を確実にするためです。これはサンプル・試薬の扱い、文書業務すべてを含んでいます。

すべての検査室の検査台は少なくとも一日に一回100%のエタノール洗浄剤を使用し、10%の漂白剤の入った水で消毒されます。これにより検査台の表面からすべての汚れを取り除きます。基礎的プロトコルでは、すべての検査台の表面と設備が少なくとも一日に一回すべての操作を工程の準備の前後に行われることを必要としています。

私たちには汚染が検出不能なレベルであることを保証するために、少なくとも一週間に一回、DNA抽出・PCR作業の2つの検査室でDNA増幅の有無のチェックのために清潔にされます

サンプル受付
 

  1. サンプルは受付で種類によって分類されます。受託したサンプルを受託用スペースに移動します。
  2. サンプルが入った封筒が、開封され、処理されます。各サンプルが、そのサンプルだけの容器に名前と関連した情報が記録され、バーコードでラベリングし、検査室トラッキング・システムに移動されます。
  3. 研究所専用のオーダーフォームが、ラボトラッキング・システムと入金決済用システムの設定に使用されます。各参加者の個人情報、人種、関係がこのステップで入力されます。
  4. 注文番号はケースごとに割り当てられます。システムを通して検査報告の経過を確認するとき、この注文番号がケースごとの基本識別となります。
  5. 各ケースの各サンプルは注文番号とリンクしています。依頼された検査の種類とサンプルの種類によって、サンプルは適切な抽出工程のために分類し並べられます。

抽出

メインの抽出作業(綿棒サンプル)ではQIAGEN BioRobot8000にて実行されます。(QIAGEN BioRobot8000は同時に、4枚のプレートに96のサンプル(合計384のサンプル)を抽出し、管理できます。一団の抽出作業は、モニターで品質管理を行い、汚染の可能性を検出します。これは 試薬の品質と検査の特異性を確実にさせます。

人的な抽出作業

  1. 各参加者は通常3本の綿棒を検査に使用するために提出します。 正常な工程ではDNAを自動的に抽出するために1本の綿棒を使用します。 分析結果に『否定』の判断が行われた場合として、確認の2重検査用にもう1本を使用します。最後の1本はDNA情報を入手できない状況の場合の予備として、また他の検査(Y染色体、mtDNA鑑定など)のオプショナル用として保管されます。
  2. サンプルがプレート中から抽出されると、残りの工程を含めてコンピュータ管理によりロボット化されたシステムですべての液体転送がされ、サンプルの位置は維持されます。

保管

  1. 抽出された各DNAプレートがバーコード付きであるので、われわれの情報システムは、指定されたDNAがプレートの位置を正確に判別することができます。抽出されたDNAプレートは、更なる処理のためのPCRの設定に送られます。
  2. この工程後、検査の終了が確認できるまでプレートは4度の冷蔵室か-20度の冷凍室に保管されます。
    通常すべての親子鑑定に関連した抽出DNAは、6ヶ月保管された後に処分されます。
    当社のDNAバンキング(25年保存)以外のデータの保存期間は5年(私的検査で1年)です。
  3. 処分されることになっているすべての生物由来の物質は、完全に消去するために焼却されます。顧客の要求により、検査終了後すぐに使用したサンプルを消去することもできます。

PCRのセットアップ

  1. PCR用のすべての試薬材は光や熱の影響を受けない無菌の専用箱の中にあり、表示に必要な蛍光性のラベルを最適な感度で行えるように、また確実に汚染を防ぐために冷凍材上に置かれています。
  2. 抽出されたDNA、PCR諸手続、管理は自動的に384枚のプレートに自動的に処理されていきます。

増幅

 

  1. PCRのセットアップに、プレートは増幅検査に移されます。この時、プレートが入った専用の容器(パススルーボックス)は検査室内の専用の一歩通行の道を通ることになります。パススルーボックスは、増幅部門で汚染を最小 限にし、単一方向の作業の維持を助けます。
  2. 研究所では、ABI9700サーマルサイクラーを利用します。これらの作業は、集中コンピュータにネットワークで結ばれています。集中コンピュータは、検査の種類と増幅したマーカーに依存した特異的増幅の作業観察に役立ちます。検査情報システム(LIMS)では、機器や観察記録がどのプレートで稼働しているかを記録して、追跡することができます。

 

抽出

  1. 増幅後に、増幅されたDNAはBiomek FX(バイオメック・エフエックス)ラボラトリーオートメーションシステム上でホルムアミドと合成され規格サイズにされます。ホルムアミドは、「DNA amplicon」と呼ばれるPCR 産物の特性を奪わせて、検出と電気泳動を容易にする化学物質です。規格サイズは「ラダー」(物差し)と呼ばれています。ラダーはそれが特異的断片サイズのために各対立遺伝子座が関連容器に正しく位置しているのを確実にします。
  2. プレートは、変性を容易にするために数分間急速に96度で加熱されて、次に変性をして伸びたDNAをまた数分間冷凍され冷凍室に置かれます。
  3. そして、プレートはABIの検出機器に移されます。私たちは異なる役割の機器を組み合わせて使用します。私たちは基礎研究・開発にABI3100を使用します。高処理量配列ではABI3700を使用し、最終的に私たちは高処理量のフラグメント分析作業にはABI3730を使用します。
  4. プレートが分析で実行されると、すべての品質管理の実行を保証するために、短期間の収納として検出冷蔵庫に保管されます。

 

分析

  1. 検査追跡システムでは、自動的に検出機器からデータをアップロードして、GeneScanとGenoTyperソフトウェアプログラムを実行します。これらのプログラムは、それぞれの作業とサンプルの品質を評価して、分析された各断片を特定の対立遺伝子座を割り当てるために使用されます。
  2. 検出作業で行われた各サンプルは2名の独立した分析アナリストによって分析されます。彼らの決定は検査情報システムによって比較され、すべての矛盾の解決には主席アナリストによって行われます。
  3. 綿棒のサンプルは1本づつそれぞれの作業から抽出されます。分析結果に『否定』の判断が行われた場合として、確認の2重検査用にもう1本を使用します。作業は、実の母親が参加した場合は疑父のサンプルを再抽出し、母親が参加しない場合は、疑父と子どもを改めてサンプルから再抽出を行って分析結果を考察します。データから不十分な欠損が生じた場合には、3本目の綿棒が使用され分析されます。

品質管理

以下の管理制御がすべての処理と実行されたプレートで行われ、アナリストの段階で再度見直されます:

  1. ネガティブエキストラクション(陰性抽出)
    これは、基本的に抽出試薬が清潔であり、増幅作業が全く起こらないことを保証するチェックです。この管理制御で出力が最大になるような場合には、全体の作業は終了し、再抽出されます。  
  2. PCRネガティブコントロール(陰性コントロール)
    ネガティブコントロールの抽出では、私たちは、PCR作業のために試薬と管理者による調合が確実に清潔になるようにして行い、疑似のピークをもたらせないようにします。
  3. PCRポジティブコントロール(陽性コントロール)
    1つ以上のコントロールが、正しい決定が各プレートでなされているかを保証するために各プレートに加えられます。陽性コントロールではNIST SRM*1、CEPH DNA*2、および従業員のDNAサンプルの組み合わせを使用します。これらのコントロールはわたしたちにとって各プレートが正しく実行され、データの変異がない正しい検査結果を与えて、汚染防止の評価を保証させることになります。
  4. DNAラダー
    特定の容器に並べられた各サンプルの対立遺伝子座は処理された規格サイズによって定義され、各ラダーにおいて意味づけされます。品質管理チェックは、各対立遺伝子が所定の容器に位置されていることを保証するために実行されます。
  5. アナリストと実行作業のデータ照合
    アナリストは(『否定』の分析結果の場合は2度の)実行作業と2つの独立した再考証とで一貫性を確実にします。これは各人の遺伝子型の最大4つのユニークな解釈と再考証になります。

*1:国立標準技術研究所において測定されているヒトに含まれる標準物質
*2:ヒト多型研究センターでマップ化されたDNA

報告

 

  1. 主席アナリストが各個人のために最終報告書を印刷します。
    書類チェックの責任者によるケース・ファイルとレポートの再考証が、検査追跡システムで結果の誤値がないことを保証するために行われます。
  2. 次に、最終報告書はケースごとに研究所責任者、研究所マネージャ、研究所ディレクターにより再検討されます。
  3. すべての再考が行われると、報告書には最終的な責任者が署名を行い、最終的な事務処理のためにカスタマーサポートに渡されます。

結果の送付

  1. カスタマーサポートではケースごとに見直して依頼者が望む連絡方法をチェックします。
  2. 鑑定書を郵送にて送付するケースが大半ですが、サービスによってはFAX、電話、メールによって報告します。

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